本科生專業(yè)畢業(yè)論文
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【摘 要】
目的研究還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(A/R)損傷的影響。方法建立心肌細胞A/R損傷模型，隨機分為5組：A組，正常對照組;B組，單純?nèi)毖?復氧(A/R低氧2h，復氧1h)組;C、D、E組為還原型谷胱甘肽處理組，加入還原型谷胱甘肽(GSH)分別使其終濃度為40、80、160mg/L，后A/R。于復氧后測定各組培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)變化及細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和細胞存活率。結果與正常組相比，單純低氧/復氧組LDH漏出量、MDA水平顯著升高(P<0.01)，細胞存活率顯著降低(P<0.01)。與缺氧/復氧組比較，各谷胱甘肽處理組上述變化明顯減輕(P<0.05)。結論還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細胞A/R損傷具有保護作用，并具有濃度依賴性。
【關鍵詞】
還原型谷胱甘肽,心肌細胞,缺氧,復氧
1材料與方法
1.1材料實驗用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山東大學實驗動物中心提供，雌雄不拘;DMEM培養(yǎng)基由愛博公司出品;胎牛血清為美國Gibco公司出品;胰酶為Sigma公司出品;丙二醛(MDA)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購自南京建成生物研究所;還原型谷胱甘肽(古拉定)由LaboratorioFarmaceuticoC.T.S.R.1生產(chǎn)(批號：4027)。
1.2乳鼠心肌細胞培養(yǎng)無菌取出生1～3天大鼠乳鼠心臟，剪碎后用0.25%胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15%胎牛血清的高糖DMEM中止消化，離心取心肌細胞沉淀，加入培養(yǎng)液，集中混勻制成懸液，應用差速貼壁法分離純化心肌細胞，以5×105/ml的培養(yǎng)密度接種于24孔培養(yǎng)板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后換液。
1.3實驗分組及操作程序試驗分為5組，每組重復8孔，A組為正常對照組(培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育3h結束實驗);B組為單純?nèi)毖?復氧組(A/R缺氧2h，復氧1h)：將培養(yǎng)板置于充有99.5%氮氣的缺氧孵育器中37℃密閉培養(yǎng)2h，再以95%氧氣+5%二氧化碳進行復氧1h;C組，D組，E組為古拉定處理組，加入古拉定使其終濃度分別為40、80、160mg/L。各組缺氧前、復氧前均給藥。
1.4實驗檢測指標(1)計數(shù)細胞搏動：在倒置顯微鏡觀察并計數(shù)心肌細胞搏動的頻率及節(jié)律。(2)細胞存活率計數(shù)：采用臺盼藍排斥法檢測，各組取少許細胞混懸液，0.4%臺盼藍混勻2min，按白細胞計數(shù)法在光鏡下計數(shù)藍染細胞。臺盼藍攝取率=藍染細胞/(藍染細胞+未藍染細胞)×100%。(3)LDH及MDA活性及含量測定：實驗結束后按試劑盒說明測定。
1.5統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)
2結果
2.1古拉定對缺氧/復氧心肌細胞搏動的影響正常培養(yǎng)對照組心肌細胞搏動相對恒定，節(jié)律規(guī)則;A/R組心肌細胞搏動頻率減慢，搏動幅度減弱，節(jié)律不齊，有部分停搏，與對照組相比，差異有非常顯著性(P<0.01);各古拉定處理組明顯逆轉A/R損傷造成的搏動頻率和節(jié)律異常，與A/R組比較差異有顯著性(P<0.05)。
2.2古拉定對心肌細胞缺氧/復氧損傷LDH及MDA的影響結果表明，A/R心肌損傷是十分明顯的，而古拉定能明顯減輕這種損傷，古拉定處理組各觀察指標均差異有顯著性，因此提示古拉定對于缺氧/復氧心肌細胞損害具有保護作用，且存在量效關系。
3討論
3.1還原型谷胱甘肽對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響大量研究表明，缺血再灌注期間大量氧自由基的產(chǎn)生可造成細胞損傷。氧自由基導致細胞損傷主要環(huán)節(jié)為作用于細胞外基質，使膠原和透明質酸崩解，使膜磷脂結構的多聚不飽和脂肪酸過氧化而直接損傷細胞膜;肌漿網(wǎng)和線粒體崩潰，心肌細胞在缺氧缺糖條件下，ATP產(chǎn)生減少，代謝障礙，代謝產(chǎn)物堆積，使膜穩(wěn)定性降低，溶酶體釋放，導致生物損傷、變性，使LDH釋放在培養(yǎng)基中，同時再給氧時氧自由基增加，細胞膜受攻擊，細胞膜損傷。
細胞內(nèi)LDH進一步增加，故LDH釋放量是觀測缺血再灌注損傷重要指標。脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，其含量變化可作為評定自由基生成及對膜脂質雙層結構破壞的指標。本實驗從培養(yǎng)的.未成熟鼠心肌細胞入手，排除了在體和離體灌注模型中神經(jīng)、體液因素及其他混雜細胞因素的影響，直接利用還原型谷胱甘肽處理培養(yǎng)的未成熟鼠心肌細胞，結果發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽各濃度組均可降低缺氧/復氧損傷造成的心肌細胞死亡率，減少細胞內(nèi)LDH漏出，減少細胞內(nèi)MDA生成，且存在量效關系，表明還原型谷胱甘肽對未成熟鼠心肌細胞有保護作用。
3.2還原型谷胱甘肽對缺氧/復氧心肌細胞損傷的保護機制還原型谷胱甘肽(GSH)對清除自由基有重要作用，它是機體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，它能有效清除氧化產(chǎn)生的自由基，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，并在使暴露于氧化環(huán)境的組織免受自由基損害方面起重要作用。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的作用下對有機過氧化物(ROOH)和無機過氧化物(H2O2)起重要清除作用，其還可以起維生素C還原劑的作用，使維生素C成為還原型而不斷清除超氧自由基。
近期有研究表明，GSH可維持線粒體內(nèi)膜巰基基團的還原狀態(tài)。當GSH含量下降，內(nèi)源性自由基攻擊線粒體蛋白巰基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影響線粒體氧化代謝的3個關鍵酶及電子傳遞鏈中酶的活性，NADH減少，ATP產(chǎn)生減少。另一方面，導致膜蛋白巰基氧化交聯(lián)，構型改變，線粒體膜滲透性轉運通道打開，鈣釋放增加，胞漿鈣上升，激活細胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，導致細胞膜的損傷或死亡。本實驗表明補充外源性GSH，對保護細胞膜的功能可能具有重要意義，對臨床各種疾患造成的心肌細胞缺氧/復氧損傷有保護作用。
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